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临床多重耐药菌基因组编辑研究取得进展

2019-11-06 微生物研究所
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语音播报

  直接在临床分离的多重耐药菌中进行功能基因组学研究是解析耐药机制以及开发抗耐药策略最直接?#34892;?#30340;方法。然而,由于缺乏能在临床耐药菌中直接进行高效基因编辑的工具,目前耐药机制仍主要是采用组学分析加在模式菌中的异源验证进行研究。这种脱离了临床耐药菌?#26087;?#36951;传背景的研究策略,往往忽略了遗传背景?#26087;?#23545;耐药因子的影响以及不同耐药因子之间的相互关系,很多时候无法对临床抗耐药研发提供真正?#34892;?#30340;依据。开发一种能与临床菌复杂各异的基因型兼容、并且简便高效的基因组编辑方法将有助于打?#26222;?#19968;研究壁垒。

  中国科学院微生物研究所向华团队长期?#37038;?#24494;生物CRISPR-Cas系统分子机制的研究,在致力于开发基因编辑新元件新机?#39057;耐?#26102;,近年来积极倡导利用原核微生物自身的CRISPR-Cas系统发展重要原核微生物基因组编辑技术,推动对微生物世界生命机制更加深入系?#36710;?#29702;解和开发应用。115日,向华团队和香港大学闫爱新团队联合在Cell Reports上发表了题为Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa 的文章。作者以多重耐药研究中最重要的标准参照病原菌铜?#30899;?#21333;胞菌作为研究对象,报道了在临床多重耐药铜?#30899;?#21333;胞菌中开发基于内源性I-FCRISPR的、高效简便的基因编辑系统,并在该系?#36710;?#36741;助下,实现了在临床多重耐药菌株自身遗传背景下耐药机制的原位解析和抗耐药化合物的筛选。

  铜?#30899;?#21333;胞菌是当前亟需关注的七?#26893;?#21407;细菌“ESKAPE?#20445;?#32928;球菌属,金黄色葡?#20122;?#33740;,克雷伯菌,鲍曼不动杆菌,铜?#30899;?#21333;胞菌和肠杆菌属)之一。由于该病原菌极易产生多重耐药性,现有的抗生素疗法不仅不能?#34892;?#22320;根治其感染,阻止耐药性的传播,还会破?#37011;?#20027;的益生菌?#28023;?#23545;人体健康产生极大的副作用。早先,闫爱新团队对2015-2016年香港玛丽医院各?#25351;?#26579;性疾病包括伤口、尿道、耳部、脓液、引流液及血?#28938;?#26579;的患者中分离?#32784;碳?#21333;胞菌进行了耐药检测并报道了一株有潜在流行性特征的多重耐药菌PA154197。然而,研究人员尝试了传?#36710;?#21452;交换同源重组策?#38498;?#22522;于外源Cas9的双载体编辑系统均未能实现对该菌株基因组的编辑,这严重阻碍?#30805;?#20854;耐药性机制的深入解析。全基因组测序结果显示PA154197含有1个完整的内源性I-FCRISPR-Cas系?#22330;?#20182;们通过与向华团队合作,基于该系统共同开发出了一套具有抗性基因和报告基因双筛选标记的单质粒基因编辑系?#22330;?#35813;系统包含一个由?#31185;?#21160;子(Ptat)驱动的mini-CRISPR元件(用于表达crRNA)和luminescence报告基因(luxCDABE)(用于辅助阳性克隆筛选),并同时含有同源重组的donor片段和用于克隆筛选的卡那?#39038;?#25239;性基因。通过电转法将该质粒转入PA154197后,研究人员通过对具有明?#26434;?#20809;信号的转化子进行进一步PCR及测序验证,能够快速(一周以内)获得阳性克隆,并同时实现?#30805;?#20854;基因组高效、多样化的精准编辑(包括基因敲除、DNA插入和定点突变等)。值得一提的是,基于荧光信号的阳性克隆初筛策略巧妙地规避了耐药菌在抗生素筛选下假阳性率高的难题,大大降低了克隆筛选的工作量。进一步的研究表明这一系统也适用于其它含有I-FCRISPR的环境和临床铜?#30899;?#21333;胞菌株,如分离自北太平洋的Ocean-100和另一株临床菌株PA150567。基于这套高效的基因编辑系统和前期的基因组与转录组分析,研究人员构建了一系?#22411;?#21464;菌株并揭示了PA154197中三个关键的耐药突变(mexR:T226G; mexT:8bp 缺失;gyrA:T248C)以及它们之间显著的协同关系。随后利用这一系?#22411;?#21464;菌株对多种抗菌化合物进行了耐药性检测,研究人员发现该耐药菌对阳离子拟肽类小分子(Small Cationic Peptidomimetics)与多种抗生素表现出显著的?#21512;?#20851;的伴随性敏感现象(Collateral Sensitivity),并且该伴随性敏感现象主要?#35272;?#20110;其中的一个耐药突变(mexT)。最后研究人员证明?#25628;?#31163;子拟态类小分子通过作用于耐药菌?#32784;?#33180;从而能够显著提高该耐药菌对抗生素的敏?#34892;裕?#20197;及阳离子拟态类小分子与抗生素的联用能够?#34892;?#22320;抑制耐药菌的生长并对耐药菌有特异高效的杀灭效果。

  该研究首次利用内源性I-FCRISPR系统实现?#30805;?#22810;重耐药菌的基因编辑,由于I-FCRISPR系统普遍存在于多重耐药?#32784;碳?#21333;胞菌中(70%),这将为临床耐药菌的研究提供高效、简便的基因编辑方法和一种原位耐药?#36234;?#26512;的新策略。此外,该研究对临床多重耐药菌的耐药机理进行了解析并发现了该菌对阳离子拟态类小分子的伴随性敏感现象。这一新发现将为解决临床抗耐药应用提供新的思路和手段。

  香港大学博士徐泽凌和中科院微生物所副研究员李明为该文章共同第一作者,闫爱新和向华为共同通讯作者。相关工作得到国家自然科学基金和香港大学等相关基金的支持。

  论文链接

  图:临床多重耐药铜?#30899;?#21333;胞菌基因组编辑、耐药机?#24179;?#26512;及防治策略(摘自Cell Rep, 2019: doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.006

打印 责任编辑:?#24230;?#20248;
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